Оптика биологических систем В. П. Мальцев д. ф.-м. н., зав. каф. биомедицинской физики НГУ (Институт химической кинетики и горения СО РАН) 10 декабря 2002 г.

Практически то же самое я рассказывал месяц назад в Калифорнии для специалистов, которые занимаются разработкой аппаратуры и, вообще, методов диагностики биологических систем. Вы уже знаете, что биология на 90% состоит из клеток. Что такое диагностика биологических систем? Это значит нужно развивать какие-то методы, которые позволяли бы вам идентифицировать клетки, анализировать их, характеризовать их морфологические признаки или хотя бы различать.

Начну я, пожалуй, с самой элементарной оптической системы, которой занимаются физики — это микроскоп. Это началось, примерно, в 1600 году. С тех пор микроскопия развивается в направлении определения параметров тех биологических объектов, которые они наблюдают. Настолько они довели свой любимый микроскоп до совершенства, что сейчас в любой биологической лаборатории есть этот прибор. Вот когда мы говорим о конфокальной микроскопии это уже продукт прошлого века, это примерно 50 годы. Я имею в виду 1900 годы. Конфокальная микроскопия — это продукт, связанный с выдвижением на первый план лазерных систем. Она создает совершенно уникальные возможности с точки зрения увеличения разрешающей способности микроскопа. Мы это немножко разберем.

Я расскажу Вам, чем я конкретно занимаюсь. Я занимаюсь проточной цитометрией. Что такое проточная цитометрия, я тоже расскажу.

Все начинается с Галилея, который изобрел телескоп. В той академии, в которой он числился членом академии, сделали как раз тот первый предмет, который назывался микроскопом. Вот такой микроскоп был изобретен Галилеем и, примерно, все это случилось в 1590 году в Голландии.

Рис. 1. Микроскоп Галилея

В то время зарождение капитализма проходило очень интенсивно, развивались технологии и в частности технология изготовления линз.

Вот так это выглядело: надувалось стекло, и образовывалась подложка, потом отдельной трубочкой пузырек выдувался, получалась линза. Так появились первые линзы, которые начали составлять и получились те первые оптические инструменты, которые мы сейчас с вами имеем.

В России было время правления Ивана Грозного, когда в Европе появился первый микроскоп. Как только разрешающая способность прибора достигла 20 микрон, начали смотреть на ткани, т. е. зародились эмбриология, гистология.

Рис. 2. Развитие микроскопии 1590 Голландцы Янсены создали первый составной микроскоп. 1660 Марчелло Мальпихи — первый микроскопист, отец эмбриологии и гистологии. 1665 Роберт Хук создал составной микроскоп, позволивший разглядеть отдельные клетки. 1676 Антиони Ван Ливенгук создал микроскоп с 250-кратным увеличением и увидел бактерии. В течение 19 века микроскоп прошел путь от примитивного инструмента к сложному изделию. Была решена проблема хроматической и сферической аберраций, предложена иммерсионная система, и т. п.

Следующий этап был достаточно значительный. Это этап Левин Гука, который открыл бактерии с помощью придуманного им микроскопа с увеличением в 250 раз. Не будем останавливаться на остальных веках, достаточно сказать, что в течение этого века микроскоп прошел от того прибора, который Вы только что видели, до современного и были решены принципиальные проблемы, связанные с аберрациями. Хроматическая аберрация, связана с тем, что сет с различной чистотой преломляется по-разному (это проблема была решена в 19 веке), также была решена проблема сферической аберрации, плюс было введено понятие иммерсионной системы. И вот что, в конце концов, представляет из себя микроскоп, тот инструмент, который не изменяется уже на протяжении 50 лет.

Рис. 3. Современный микроскоп Расстояние от окуляра до объекта = 195 мм Длина трубки = 160 мм Фокус объектива = 45 мм Современные микроскопы конструируются по стандартам: DIN — немецкий стандарт; ISO — стандарт, принятый в США

Я думаю, Вам это пригодится. Итак, основные параметры микроскопа. Вы знаете, что такое числовая апертура объекта? Числовая апертура объекта очень важное понятие с точки зрения разрешения микроскопа. Разрешающая способность равна длину волны умножить на показатель преломления и умножить на Sin угла угловой апертуры.

Разрешающая способность связана с лямбдой, чем больше лямбда, тем меньше разрешающая способность и чем больше числовая апертура, тем лучше разрешающая способность. Значит типичная разрешающая способность для объектива, если сухой объектив, имеется в виду между объективом и вашим предметным стеклом нет ничего, кроме воздуха, тогда числовая апертура не может быть больше, чем 0,95, но если Вы используете иммерсионную жидкость, то ситуация меняется. Что такое иммерсионная жидкость? Это жидкость показатель преломления, совпадающая с показателем преломления стекла, т. е. между объективом и покровным стеклом, которое покрывает Ваш объект, еще заполнено этой жидкостью. Преломление на границах слабое и не ухудшает ситуацию с разрешающей способностью.

Вопрос Золкин А. С.: Скажите план Вашей лекции?

Сначала мы рассмотрим микроскопию, потом конфокальную микроскопию. Далее современные возможности и проблемы, которые есть, потом проточную цитометрию.

Вопрос Золкин А. С.: Какое будет иметь отношение лекция к тем проблемам, которые решает кафедра?

Самое прямое отношение, если студенты кафедры распределяются, то они попадают в те биологические лаборатории в которых, к сожалению, используют тот самый тривиальный микроскоп, который у Вас показан, ни конфокальный микроскоп, ни проточный цитометр, пока нашим биологам не доступен. Но если туда будут приходить физики, они сами все сделают.

Вопрос Золкин А. С.: Вы называете делать то, что уже сделано за рубежом?

Не совсем. Я покажу технологию получения новых знаний.

Вопрос Золкин А. С.: Вы расскажите о тех проблемах, которые решаются с помощью этой методики? Нас собственно очень интересует эта часть.

Здесь можно наглядно посмотреть, как меняется разрешающая способность в зависимости числовой апертуры, и разделяются те частицы, которые раньше были скрыты. Потом началось развитие конфокальной микроскопии с того, что решили усовершенствовать флуоресцентный микроскоп. Флуоресцентный микроскоп представляет собой источник излучения, который возбуждает флуоресценцию в образце и дихроичное зеркало, которое пропускает только основное излучение (остальное отражает), попадает в окуляр и Вы наблюдаете флуоресценцию. Что такое конфокальный микроскоп? Конфокальный микроскоп практически не отличается от флуоресцентного, который сильно увеличил возможности в распознавании биологических объектов. Здесь вместо окуляра стоит диафрагма. Диафрагма совпадает с диафрагмой источника, и Вы регистрируете не глазом, а фотоумножителем. Если у Вас есть возможность сканировать, то можете записывать изображение.

Рис. 4. Сравнительные размеры области фокусировки обычного (слева) и конфокального (справа) микроскопов

Конфокальный микроскоп практически не отличается от флуоресцентного микроскопа. Как выглядит изображение в конфокальном микроскопе? Если Вы в объектив обычного микроскопа смотрите и видите его просто глазом, то в конфокальном микроскопе Вы не сможете видеть изображение просто глазом. На конфокальном микроскопе изображение Вы увидите только на экране компьютера. Область фокусировки в обычном микроскопе выглядит вот так, а в конфокальном микроскопе она в 10 раз меньше, за счет того, что диафрагма на приемнике очень маленький рабочий размер. Вот так выглядит изображение обычного микроскопа, а это изображение конфокального микроскопа.

Рис. 5. Изображения объекта, полученные с помощью обычного (слева) и конфокального (справа) микроскопов

Конфокальный микроскоп очень серьезная машина, связанная с компьютером. Управляется естественно от компьютера.

Рис. 6. Схема оптической части конфокального микроскопа, на котором получено рекордное оптическое разрешение (30 нм)

Здесь большое количество шаговых двигателей, которые управляют положением самой клетки в фокусе этого конфокального микроскопа, и еще Вы можете фокусировать точку по Z координате, т. е. тем самым изменять глубину. Измеряя в нескольких сечениях можно после этого делать трехмерное изображение объекта. Это все сделано с помощью конфокального микроскопа. Следующее улучшение было связано с тем, что оптики использовали такое явление, как двухфотонное поглощение. Используя двухфотонную микроскопию, т.е. возбуждаете инфракрасным излучением флуоресценцию красителя, которые находятся на клетке, а регистрируете в видимой области. Удалось в 2 раза увеличить разрешение и довести его до 100 нанометров, т. е. оптический микроскоп с двухфотонным возбуждением позволяет разрешать предметы которые в размере 100 нанометров, это уже значительно меньше, чем длина волны. Я Вам покажу последний результат 2002 года. Вы знаете, что максимальный сверхкороткий импульс света, 6 фемтосекунд. Примерно такого же класса цифра, это максимально возможное разрешение световой микроскопии — 30 нанометров. Таким образом, была измерена толщина мембраны бактерии.

Рис. 7. Мембраны бактерии (30 нм)

Это невозможно было сделать 2-3 года назад. Микроскоп — это хороший предмет для того, чтобы наблюдать отдельные предметы. Однако интересует совокупность всех клеток, не просто одна клетка, а совокупность. Как они развиваются? Существуют ли внутри этой совокупности отдельные типы? И для этого микроскоп не очень подходит.

Сколько можно за день просмотреть этих бактерий? Поэтому был предложен в начале 60-х годов прошлого века метод проточной цитометрии. Сейчас я расскажу об этой техники более подробно, т. к. используется всевозможные физические области: гидродинамика, оптика, электроника, лазерная техника. Используется все, чтобы достичь одного, исследовать клетки, но не со скоростью одной клетки в минуту, а со скоростью 1 000 клеток в секунду. Существует такая система, как гидрофокусировка. Гидрофокусировка обеспечивает прохождение каждой клетки через тестируемую зону. Дальше — освещение клеток. Для этого обычно используется лазерное излучение, которое фокусируется в размер клетки, и Вы снимаете информацию, это может быть флуоресценция или светорассеяние от каждой клетки. Что такое гидрофокусировка? Представьте себе 2 трубы, одна — большая и другая - маленькая. Клетки крови летят по внутренней трубе, а во внешней нет никаких частиц. Увеличиваем давление во внешней трубе, клетки фокусируются и выстраиваются одна за другой. Если увеличить еще давление, то внизу, где клетки пересекает луч лазера, получается, что в луч лазера залетает одна клеточка за одной. Когда клетка пересекает луч лазера, получается два явления: это рассеяние и флуоресценция. Рассеяние — это сложный процесс. Взаимодействие электромагнитного излучения без изменения длины волны обусловлено различными оптическими эффектами внутри частицы, через которое проходит электромагнитное излучение. Обычно структуру этой картины мы называем индикатрисой, она очень зависит от всех параметров частицы, это как «отпечатки пальцев» этой частицы, в то время как флуоресценция — это обычно спонтанное излучение, но излучается во все стороны одинаково.

Используют флуоресценцию для регистрации каких-то компонентов, как ДНК, белки или мембранные рецепторы.

Вопрос Как регистрируется флуоресценция в проточных цитометрах?

Клетки проходят луч лазера, потом под углом 90 градусов Вы ставите объектив и соответственно собираете флуоресценцию, выделяя ее различными дихроичными фильтрами.

Вопрос Что еще не реализовано в проточной цитометрии?

Если возбуждать флуоресценцию в клетке, то там очень много своих белков и мембранных белков. Все это тоже светится, не зависимо от того подкрашивали вы их или нет. Обычно это свечение очень короткое по времени всего несколько наносекунд. Можно использовать короткое время неспецифической флуоресценции, чтобы выделить специфическую.

Теперь я вернусь к Вашему вопросу о светорассеянии. Нельзя сказать, что светорассеяние зависит только от размера или от чего-либо конкретно. Это было бы очень красиво, взяли бы измерили интенсивность, и так как она зависит от размера, мы тем самым и определили бы размер. Нет, ничего подобного. Рассеяние зависит от всех параметров. Например, рассеяние сферической частицы зависит от размера и показателя преломления. Оно достаточно симметричное и действительно такие параметры индикатрисы, как положение и контраст, зависит все от морфологических параметров частицы, т. е. от всех параметров, есть ядро, нет ядра, размер, показатель преломления и т.п.

Вопрос Что опубликовывают в литературе?

В основном стандартные проточные цитометры, которые измеряют рассеяние вперед, выбирают линзы и измеряют интенсивность в конусе углов. Понятно, что такая информация не может быть полной, она содержит очень незначительную часть той информации, которую хотелось бы иметь. Здесь я нарисовал индикатрису различных частиц. Я готов зачислить на кафедру прямо сейчас того, кто отгадает, какая индикатриса какой частицы? Конкурс на кафедру большой. Какие есть предложения? Нужно распределить правильно, где бактерия? Где эритроцит? Где моноцит? Где полистирольная частица?

Рис. 8. Проточная цитометрия: Polystyrene bead, Erythrocyte, Monocyte, Bacterium Indicatrix is a unique characteristic of particle

Значит, таким образом, если бы у Вас была возможность измерить эту индикатрису, то Вам было бы достаточно при определенных навыках охарактеризовать эту частицу. Более того, решая обратные задачи, Вы смогли бы уже определить их параметры. Нам удалось это сделать, и вот, в отличие от проточного цитометра, мы создали технологию сканирующей проточной цитометрии. Вот сюда залетают частицы одна за другой, вот луч лазера пересекает, вот рассеяние вперед, рассеяние в бок, флуоресценция. Однако здесь есть маленькая добавка в виде второго лазера, который освещает частицу во время движения, и мы регистрируем с помощью вот этой диафрагмы только параллельные лучи. Во время движения, во время сканирования, у Вас фотоумножитель записывает всю индикатрису рассеяния, те «отпечатки пальцев» которые мы так хотели измерить.

Рис. 9. Схема оптической части сканирующего проточного цитометра

Вопрос Какие преимущества?

Во-первых: если раньше пытались измерить индикатрису, то ставили 160 фотоумножителей вокруг, или оптические световоды выводили на один фотоумножитель. В нашей системе всего один фотоумножитель и мы имеем достаточно большой диапазон угла в измерении от 5 до 120 градусов. Плюс еще высока чувствительность, за счет того, что мы интегрируем по азимутальному углу. То есть с помощью такой системы, которая запатентована в Америке, мы получили возможность измерять те самые «отпечатки пальцев» которые должны помочь нам охарактеризовать частицы. Вот так выглядит проточный цитометр.

Рис. 10. Внутри сканирующего проточного цитометра

Вопрос Где используется проточная цитометрия?

Проточная цитометрия используется в иммунологии, бактериологии.

Вопрос Как используется проточной цитометр в иммунологии?

Разберем пример, есть клетка, на поверхности которой есть белковые образования, называются эти образования антигенами. Они как будто торчат из клетки. Клетка рождает специфические антитела, если в ваш организм попадает инфекция. Эти антитела начинают продуцироваться и вступают в борьбу с внешними воздействиями на организм. Как это все измерить? Для этого нужно охарактеризовать клеточную систему. А именно: сколько клеток с определенным типом антигенов содержится в крови. Для этого вводят в сыворотку специфические антитела, они потом образуют такой комплекс, клетка + антиген + антитело + флуоресцентная метка. Дальше на проточном цитометре необходимо подсчитать отдельное количество клеток, которые несут антигены к тому или иному вирусу.

Под микроскопом этого сделать нельзя, потому что количество рецепторов на поверхности клеток мало. В проточной цитометрии Вы можете сфокусировать все излучение на одну клетку и у Вас интенсивности достаточно, чтобы зарегистрировать флуоресценцию. Так вот работает стандартный проточный цитометр. Например, можно определить даже до 7-ми разных антител. Мы занимаемся тем, что интересно физикам. Надо не просто в стационарной фазе смотреть сколько антител на клетке, а изучать сам процесс, как антитела садятся на клетки. Если Вы научитесь характеризовать сам процесс взаимодействия антигена и антитела на поверхности клетки, то Вы можете получить информацию не только о количестве, но и об активности антител находящихся в сыворотке. Вот так, в частности, выглядит кинетика взаимодействия антигена и антитела. Примерно за 1 час проходит взаимодействие и в результате Вы можете описать эту кинетику. Понятно что биологи, этого сделать не могут.

Кафедра организована, для того, чтобы можно было описывать взаимодействие антиген-антитело системой уравнений. Результирующая формула описывает эту кинетику и в результате у Вас есть константа взаимодействия антигена и антитела. Оказывается, для того чтобы этот антиген с антителом соединились, они должны 300 раз встретиться друг с другом. Более активная система требует 300 раз, а всего 50-150 раз и тем самым у биологов появляется возможность узнать концентрацию рецепторов на поверхности клетки, характеристику скорости развития болезни в организме. У нас есть в Новосибирске туберкулезный центр. Для того чтобы определить каким антибиотиком необходимо лечить больного, там люди ждут месяц. Но для того чтобы больной не умер за это время, его лечат всеми антибиотиками. Только через месяц будет готов анализ и можно сделать заключение в правильном выборе лечения, но в организме больного целый коктейль антибиотиков <А>, <В>, <С>, <Д>. За это время микроорганизмы перестроились, они уже готовы сражаться против всех антибиотиков.

Так же можно определить количество антител в сыворотке с помощью полимерных частиц. Вот результат одного из таких анализов.

Рис. 11. Результат определения количества двух типов антител в сыворотке с использованием полимерных частиц на сканирующем проточном цитометре

В результате у Вас есть разные размеры частиц и флуоресценция, соответствующая концентрации того или иного антитела в растворе. Есть еще очень интересный процесс, который можно наблюдать глазом, это система иммуноглюцинации, т.е. два полимерных шарика они слипнутся тогда, когда есть антитела в растворе, если нет антител в растворе шарики никогда не слипнутся, потому что антигены не взаимодействуют друг с другом. Представьте себе взяли сыворотку и бросили в систему с полимерными частицами, а у Вас там есть антитела. Антитела сразу же сядут на антигены и одновременно начнется процесс слипания полимерных частиц. Все это можно наблюдать в цитометре. Понятно, что если частица сферическая, то я очень легко могу отличить от частицы, которая состоит из двух сферических частиц, по тем же <отпечаткам пальцев>. В результате мы видим, как увеличивается количество вот этих димеров от времени и тем самым мы говорим, да у Вас есть в сыворотке эти антитела. Вы заболели, Ваша болезнь начала прогрессировать. С момента заражения может пройти очень мало времени.

Область биокинетика, это своего рода флаг нашей кафедры и под таким названием существует оригинальный спецкурс, который мы читаем на нашей кафедре и здесь физики должны, как раз и заняться моделированием тех процессов, которые происходят в биологии. Но не просто моделированием, а определением параметров процесса с помощью модели. Да, вирус пролез в клетку. А с какой скоростью? С какой скоростью он сел на поверхность, потом с какой скоростью прорыл он там себе отверстие, чтобы проникнуть внутрь? И так далее. Вот на такие проблемные вопросы могут ответить физики. Моделирование всех этих процессов, это как раз та самая задача, которую мы ставим перед студентами, которые обучаются на кафедре. В частности взаимодействие антигена и антитела, оно до сих пор не описано ни физиками, ни биологами. Проникновение вируса в клетку тоже никто не описал, развитие клетки и ее питание, тоже не описано в деталях. Вот эти биокинетические задачи, которые стоят перед биофизикой, они очень актуальны и сразу же выдают очень много методов, которые тут же можно использовать в клинике. В частности можно посмотреть на эритроциты.

Эритроцита достаточно сложная по форме частица и если измерить ее «отпечатки пальцев», то мы увидим вверху эритроцит в произвольной ориентации. Если подействовать на него химическим веществом он сферизуется, т. е. он превращается из такой формы в сферу и тут же индикатриса становится похожей на сферическую частицу. И после того, как она стала сферой, мы можем ее охарактеризовать и определить, что вот этот эритроцит был размером в 6 микрон и у него концентрация гемоглобина была 50 гр. на децилитр. Таким образом, фактически достаточно быстро можно охарактеризовать эритроцит. Очень удобно характеризовать течение болезни по эритроцитам, если другие клетки требуют выделения, то с эритроцитами результат можно получить сразу. После этого Вы можете строить распределения эритроцитов по размерам, по концентрации гемоглобина.

Рис. 12. Двумерная карта распределения клеток пуповинной крови, обработанной концентратором стволовых клеток. Стволовые клетки образуют облако в правом верхнем углу карты

Вот это буквально 2002 год. Это анализ крови, где была специально увеличена концентрация стволовых клеток. Вы, наверное, наслышаны о клонировании, так вот стволовые клетки связаны с клонированием и все это сейчас популярно. В частности вот эта работа была сделана по заказу японской компании. Японцам нужно было научиться определять по отпечаткам пальцев (по индикатрисам) стволовые клетки из всего многообразия клеток которые есть в крови. Нам удалось это сделать и вот такое распределение удалось измерить.

Рис. 13. Распределения клеток пуповинной крови, обработанной концентратором стволовых клеток. Стволовые клетки в пробе, выявленные стандартным анализом по флуоресценции - правый красный пик. Стволовые клетки в пробе, выявленные по светорассеянию на сканирующем проточном цитометре - зеленое распределение

Тем самым их можно потом отсортировать и на базе их можно строить эксперименты по клонированию. В частности мы исследовали стволовые клетки крови. Есть еще стволовые клетки нервной системы. Стволовые клетки крови выходят из костного мозга. Эти клетки сначала имеют ядро, ДНК и вот в зависимости от той информации ДНК они преобразуются в лимфоцит, или в эритроцит и т. д.

Все основные клетки крови: эритроциты, тромбоциты, лейкоциты. Из лейкоцитарных известны основные 5 типов клеток крови: моноциты, базофилы, нитрофилы и езинофилы.

Все они образуются из стволовых клеток. Если Вы имеете на входе стволовую клетку, Вы в принципе с помощью генной инженерии можете из нее сделать любую клетку крови. Вы имеете нервную клетку, то из нее с помощью генной инженерии можно сделать любую другую клетку, в частности тот организм, который выходит из тех нервных клеток, который зарождается при рождении. Стволовые клетки сейчас очень популярная вещь с точки зрения генной инженерии и молекулярной биологии. Наша задача научиться распознавать на фоне такого количества клеток, одну стволовую и вытащить ее, затем дать биологам, чтобы они ее изучали.

Вот эта тоже интересная картинка, это смесь бактерий кишечной палочки и полимерных частиц. Видите их можно легко разделить, посчитать отдельное количество кишечных палочек, отдельное количество полимерных частиц.

Рис. 14. Двумерная индикатриса светорассеяния кишечной палочки

Теперь можно посмотреть, как выглядит индикатриса несферической частицы. Допустим это кишечная палочка, повернутая под углом 30 градусов в направлении падения лазерного излучения. Видите, картинка становится совершенно несимметричной.

Рис. 15. Трехмерная индикатриса кишечной палочки

Вопрос Можно ли получать гранд в этой сфере и кто Вас поддерживает?

Нас поддерживает Российский фонд фундаментальных исследований, Сибирское отделение Академии наук, НАТО, японские компания «Кавасаки». Все это связано с медициной и с экспресс диагностикой. Все это интенсивно поддерживается.

Вопрос Золкин А. С.: Как на счет прогресса студентов на Вашей кафедре? Я имею в виду как быстро они будут защищаться? Какие есть возможности поехать в командировку в какой ни будь университет, например: в Японию и т. д. Расскажите о возможностях которые открываются?

На самом деле по специализации биофизиков у нас нет ни аспирантуры, ни диссертационного совета. Сейчас первый выпускник поехал в г. Красноярск и поступил в аспирантуру института Биофизики. Студенты, которые после окончания университета решили специализироваться по биофизике продолжать заниматься работой, то мы предоставляем им такие возможности, в частности у нас очень динамичные отношения с институтом Биофизики в г. Красноярске и студенты могут после окончания университета поступить в аспирантуру г. Красноярска. Сейчас мы ведем работу здесь по организации аспирантуры по биофизике на базе университета. У нас уже достаточно много ученых с опытом работы в этой области. Я полагаю, что к Вашему выпуску у Вас такая возможность появится.

Вопрос Золкин А. С.: Я думаю студентов не должно отпугивать то, что аспирантура в другом городе?

Конечно, нет.